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타겟 검증 및 발굴 실험법 : 타겟 비고정화 방식

이 포스트는 비고정화 방식의 타겟 검증 및 발굴 관련 전문 Label-free technologies for target identification and validation (Med. Chem. Commun., 2016,7, 769-777 )을 발췌한 것입니다.

표현형 기반의 스크리닝은 질병 관련 스크리닝에 있어서 일반 타겟을 표적으로 하는 것보다 오류를 줄인다.
표현형 기반의 분석을 통해서 사전에 없는 타겟은 물론 알려지지 않은 메카니즘까지 밝힐 수도 있다.

어피니티 크로마토 그래피는 복잡한 프로테옴으로부터 타겟 프로틴을 선별하는 전통적인 방식이다. 관심있는 저분자가 컬럼 내부에 고정이 되고, 결합하는 단백질을 회수하는 것이다. 다만 단백질이 많이 필요하다는 단점이 있다.

그래서, 자외선 유도 crosslinking 기술이나 photolabel 을 활용하여 적은 양의 단백질로도 결합을 분석할 수 있게 되었다.

하지만, 이와 같은 affinity 기반의 방식에는 false postive라는 심각한 문제가 따르며 레이블링 같은 어려움이 따른다. 이 논문에서는 저분자 물질에 어떠한 고정 및 modification을 하지 않고서도 분석 할 수 있는 방식이 설명되어 있다.

타겟 검증 1. Cellular thermal shift assay (CETSA)

TSA(thermal shift assay)는 정제된 단백질에 사용할 수 방법이었는데 이를 확장하여 세포에까지 적용한 기술인 CETSA 는 저분자 물질과 세포 물질간의 결합을 측정할 수 있다.
원리는 TSA과 마찬가지로 thermal stabilization이다. 우선 살이있는 세포에 리간드를 처리하여 37’C-65’C 사이의 온도로 열처리를 한다. 온도가 올라가면 단백질은 구조가 풀리면서 침전되기 시작한다. 다시 온도를 낮추면 단백질 조각과 세포 침전물을 원심분리로 분리할 수가 있다. 이 때에 리간드가 결합한 단백질은 그렇지 않은 단백질에 비해 thermal aggregation curve가 다르게 나타난다.

CETSA 의 개념도 (출처 Med. Chem. Commun., 2016,7, 769-777 )

 

타겟 검증 2. DARTS, LiP-SRM

Limited proteolysis (LiP) 는 protease가 리간드에 결합한 단백질은 분해하지 않고, free form으로 존재하는 단백질반 분해하는 것을 이용한 분석 방법이다. 이 원리를 이용한 두 가지 방식이 있다.
2009년도, Lomenick 은 drug affinity responsive target stability (DARTS)라는 이름의 기술을 발표했다. 세포추출물에 약물을 처리한 후에 protease를 넣으면 타겟 단백질만 남게 되어 분석할 수 있는 원리이다. 그러나 처리해야 하는 protease의 양이나 처리 시간 등에 대한 최적화에 많은 노력이 필요하다는 단점이 있다.

DARTS 개념도
DARTS 개념도 (출처 : Med. Chem. Commun., 2016,7, 769-777 )

limited proteolysis coupled selected reaction monitoring (LiP-SRM)은 두번의 digestion을 포함하는 방식이다. 우선 타겟물질에 약물을 짧은 시간 처리하고 protease를 처리한다. 그러면 약물과 결합한 타겟만이 남을 것이다. 이를 trypsin으로 처리해서 프로테오믹스 분석을 한다. 대조구로 타겟에 약물을 처리한 후 첫번 째 protease 처리 없이 바로 trypsin을 처리하고서 그 차이 점을 분석하면 타겟과 약물간의 결합에 대한 분석이 가능하다. 다만, 이 또한 분석시간이 길게 소요되고, 오랜 최적화가 필요하다. 또한 살아있는 세포에는 적용이 어렵다.

LiP-SRM 개념도
LiP-SRM 개념도 (출처 : Med. Chem. Commun., 2016,7, 769-777. )

 

타겟 검증 3. SPROX

Stability of proteins from rates of oxidation (SPROX)는 구아닌이나 유레아 같은 화학적 변성제를 이용해서 단백질에 화학적 변성을 일으킨 후에 과산화 수소를 처리해서 메티오닌의 산화를 유발한 후에 산화된 메티오닌을 측정하는 방법이다. 약물과 반응 했을 때와 반응하지 않았을 때의 차이를 분석하는 것이다.
변성된 단백질의 반응률 (reaction rate constant)와 변성되지 않은 단백질의 반응률을 통해서 반응 역학에 대한 상세한 정보를 얻을 수 있다는 것(Nature Protocols volume8, pages148–161 (2013))이 가장 큰 장점이다. 그 외에도 변성 방법에 따라서 바인딩 포켓을 알아낼 수 있다는 점 또한 장점이 된다.

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